悬浮细胞的传代与培养

悬浮细胞的传代

              悬浮细胞传代比贴壁细胞传代稍微简单一些。由于细胞已经在生长培养基中的悬浮，因此无需通过酶的作用使其从培养容器表面脱离，整个过程较为迅速，对细胞的损伤也较小。悬浮培养时不进行生长培养基的更换；而是每2到3天加料一次，直到细胞汇合。可以直接在培养瓶中稀释细胞，然后继续培养扩增，或者也可以从培养瓶中取出一部分细胞，将余下的细胞稀释到该细胞系适宜的接种密度。悬浮细胞的传代后的延滞期一般比贴壁细胞要短。

悬浮细胞培养容器

              悬浮培养可采用未经组织培养处理的无菌培养瓶（例如：不嗲折流板的摇瓶）进行；但是，专为悬浮细胞培养设计的转瓶（搅拌瓶）具有出色的气体交换功能，可进行较大规模的细胞培养。

             转瓶有两种基本设计；其培养基由悬挂的搅拌棒或者垂直的叶轮搅拌（即搅动）。垂直叶轮的换气效果更佳。转瓶总培养体积不能超过转瓶标示体积的一半，以便换气充分（例如：500ml转瓶中培养液体不能超过250ml）。  

所需材料     

1. 装有悬浮细胞的培养容器
2.  不带折流板的摇瓶或者转瓶
3. *生长培养基，预热至37℃
4. 37℃培养箱，充有二氧化碳浓度为5％的湿化空气
5. 磁力搅拌盘（如果使用转瓶）、滚架（如果使用滚瓶）或者摇床（如果使用传统培养瓶或者培养皿）
6. 用于活细胞和总细胞计数的试剂和设备（例如：countess™||自动细胞计数仪、台盼蓝染料或血球计数器。）

悬浮细胞传代流程

             所有与细胞接触的溶液和设备均应为无菌状态。必须采用正确的无菌技术，并且在层流通风橱内进行。传代应在细胞处于对数期、未达到汇合状态时进行。达到汇合状态时，悬浮培养的细胞会聚集成团块，转动培养瓶时培养基会变得浑浊。传代前所建议的大细胞密度随细胞系不同而有所差异。

            使用摇瓶进行细胞培养时

                                   以下实验方案介绍了利用振荡培养箱和摇瓶进行哺乳动物细胞悬浮培养时传代的一般流程。详细的实验方案，必须参阅针对具体的产品说明书。

注：应确保摇瓶中无折流板（即：位于培养瓶底部用于搅动的齿形板），因为折流板会破坏摇动节奏。

1. 当细胞适合传代（即：处于对数生长期未达到汇合状态）时，从培养箱取出培养瓶，使用无菌吸管从培养瓶中取出少量细胞样品。如果吸取样品前细胞已经沉淀，应转动培养瓶，使细胞在培养基中均匀分布。
2. 通过此样品，采用countess™||自动细胞计数仪或者血球计数器、细胞计数仪按照台盼蓝拒染法测定总细胞数和活细胞百分比。
3. 计算将细胞稀释到推荐接种密度时需要加入的培养基体积
4. 在无菌状态下将适量预热的生长培养基加入到培养瓶中。必要时可将培养的细胞分到多个培养瓶中。
5. 将培养瓶的瓶盖旋开一圈，以便进行充分的气体交换（或者使用透气性瓶盖），并将培养瓶放回振荡培养箱。摇晃速度取决于具体的细胞系。

      注：为了尽量减少细胞碎片和无用的代谢副产物在振荡培养体系中蓄积，每三周（或者必要时）应将细胞悬液轻轻离心一次，离心力为100×g，时间为5-10分钟，然后用新鲜的生长培养基重新悬浮细胞沉淀。

       使用转瓶进行细胞培养时

 以下实验方案介绍了利用转瓶进行哺乳动物细胞悬浮培养时传代的一般流程。详细的实验方案，必须参阅针对具体的产品说明书。

     请注意细胞对物理剪切作用很敏感。应确保叶轮可自由转动，不会触碰到容器壁或底部。叶片顶部应稍微高于培养基。以确保培养系统换气充分。调节转动装置，使叶片不会触碰容器和底部。下表列出了不同尺寸转瓶所需的小培养基体积。

我们建议开始旋转培养时转瓶容器不要超过500ml。建议从方法成熟、体积较小的转瓶开始逐步扩大培养规模。

1. 当细胞适合传代（即：处于对数生长期而未达到汇合状态）时，从培养箱中取出培养瓶，使用无菌吸管从培养瓶中取出少量细胞样品。如果吸取样品前细胞已经沉淀，应转动培养瓶，使细胞在培养基中均匀分布。
2. 通过此样品，采用countess™||自动细胞计数仪或者血球计数器、细胞技术仪按照台盼蓝拒染法测定总细胞和活细胞百分比。
3. 计算将细胞稀释到推荐接种密度时需要加入的培养基体积
4. 在无菌状态下将适量预热的生长培养基加入到培养瓶中。必要时可将培养的细胞分到多个培养瓶中
5. 将培养瓶的瓶盖旋开一圈，以便进行充分的气体交换，并将培养瓶放回培养箱。转速取决于所用细胞系和叶轮类型。应确保转速始终在推荐值范围内，以免剪切应力导致细胞损伤。

注：为了尽量减少细胞碎片和无用的代谢副产物在振荡培养体系中蓄积，每三周（或者必要时）应将细胞悬液轻轻离心一次，离心力为100×g，时间为5-10分钟，然后用新鲜的生长培养基重新悬浮细胞沉淀。

悬浮昆虫细胞传代的注意事项

                     虽然昆虫细胞传代的一般步骤与哺乳动物细胞相同，但是这些培养系统的一些关键要求有所不同。为了获得满意结果，实验中必须严格遵守所用昆虫细胞系附带的操作说明。

1. 进行细胞悬浮培养时无需更换培养基。定期传代时需要吸出细胞悬液，然后加入适量培养基，将细胞稀释到适当密度。添加新鲜培养基后可使细胞营养素达到*补充。
2. 培养昆虫细胞时建议不要用二氧化碳交换。
3. 昆虫细胞应于27℃、非湿化环境中培养。可将细胞放在操作台上或者放入抽屉中于室温下培养。但是，建议使用温度控制在27℃的环境。
4. 使用昆虫细胞的培养基。
5. 使用表面活性剂降低剪切作用。进行昆虫细胞旋转培养时建议使用0.1％pluronic™。F-68pluronic™ F-68（BASF)是一种表面活性，可降低叶轮导致的细胞膜剪切作用 注：sf-900||SFM和expressFive™ SFM中已经含有表面活性剂。
6. 某些昆虫细胞可能需要一定的过程来适应悬浮培养。更多信息，请参阅针对具体细胞的产品说明书或操作手册。
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