贴壁细胞传代的培养技巧

如何传代贴壁细胞？

细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。一般使用蛋白水解酶（比如胰蛋白酶）消化贴壁细胞成单个细胞，也可加入乙二胺四乙酸（EDTA）提高消化能力，EDTA 是一种二价离子的螯合剂，能抑制细胞膜上的Ca²⁺和Mg²⁺。常用的细胞消化液一般含有0.25%(w/v)的胰酶和0.03% (w/v) EDTA，一般用不含Ca²⁺和Mg²⁺的盐溶液配置，先用胰酶-EDTA 消化液清洗细胞（5.0 -10.0 ml/75cm），然后弃去消化液，重新加入少量的胰酶-EDTA 消化液(2.0 to 5.0 ml/75 sq. cm flask) ，观察细胞直到细胞变圆脱离瓶壁，此过程一般需要5-15分钟，为了避免细胞成团，消化细胞的过程中不要拍打细胞瓶。对于特别难消化的细胞，可以加入胰酶EDTA 消化液后把细胞置于37°C 促进消化，细胞脱离瓶壁后，立刻加入含有血清的*培养基中止消化，血清中某些蛋白质能够抑制胰酶的活性。一般情况下，离心并不需要。如果细胞需要无血清或者低血清的培养基，可以以125000g 转速离心5分钟，然后弃去中止用的培养基，加入适合的新的培养基轻轻混匀细胞，移入到新的培养瓶。传代的比例视细胞类型而定，一般是1:2-1:20，具体比例可参考说明书。胰蛋白酶会对某些细胞的细胞膜产生损伤，对于这种类型的细胞，可用细胞刮轻轻刮下细胞，加入适量的培养基，轻轻吹打混匀细胞，然后进行传代培养。

传代细胞的频率多久较合适？

 传代是指把细胞从一个培养瓶移到另一个培养瓶，传代的间隔是指两次传代之间的时间。贴壁型的细胞的汇合度达到或者接近100%的时候，需进行传代操作，但是，有些细胞以克隆的形式生长，汇合度永远达不到100%，对于这种类型的细胞，细胞达到或者接近大密度的时候，就需传代。接触抑制型细胞（比如3T3）需要在细胞长满之前传代以避免产生细胞长满后接触抑制后产生性状的改变。悬浮型的细胞必须在细胞达到大饱和密度之前传代，悬浮细胞传代时只需稀释至合适的密度，让细胞有充足的营养恢复到对数生长期。如果仅仅是简单的换液，而且细胞数量不减少，细胞将会快速耗尽营养而死亡；如果细胞稀释到低密度之下，细胞将会进入停滞期而不增殖或者死亡。不同的悬浮细胞的大饱和密度和传代的间隔与比例是不同的，所以，培养悬浮细胞要每日观察。

胰酶消化传代的浓度是多少？是否含EDTA？浓度？

胰酶消化传代的一般浓度为0.25%，部分细胞由于贴壁较紧，需要加0.53mM 的EDTA，如果做原代培养，胰酶的浓度需要做适当的提高。

细胞传代消化时所用胰酶浓度越高越好吗？

不见得！因为胰蛋白酶溶液的消化能力是和溶液的pH、温度、胰酶浓度及溶液中是否含有Ca²⁺, Mg²⁺和血清等因素有关。通常情况下，pH 8.0 , 温度 37 ℃ 其作用能力优势。另外，钙、镁离子及血清均能大大降低其消化能力。我们每次进行传代消化前，一定要用D-Hanks液或PBS液反复冲洗细胞培养瓶，以便于将含血清的培养基冲洗干净，这样就能大大提高消化液的消化能力。通常使用的消化液浓度为：
（1）0.05％胰蛋白酶＋0.02％EDTA；
（2）0.25％胰蛋白酶＋0.03％EDTA。
（3）0.25% 胰蛋白酶
溶液pH8.0~9.0；使用D-Hank液配制。 
多数细胞传代消化可使用0.05％胰蛋白酶＋0.02％EDTA这种消化液。  

能否使用细胞说明书上不同的培养基来培养细胞？

产品目录或者细胞说明书上的推荐的培养基一般是细胞株的原始提供者推荐的培养基或者已经经过验证的对该细胞株合适的培养基，细胞对未推荐的培养基也许会适应，也有可能不适应。对于更换培养基，应谨慎对待，更换培养基时，应留一瓶细胞使用推荐的培养基培养，留作种子。更换培养基有两种方法，简单的方法是直接更换培养基，强制使细胞适应新的培养基；还有一种更温和的方法：传代细胞的时候分成细胞两瓶，一瓶使用原来推荐的培养基，第二瓶使用50%原来推荐的培养基，50%新的培养基，之后仔细观察细胞的生长状态，如果第二瓶细胞生长状态不好，应立即停止更换培养基，如果第二瓶生长状态好，可以继续传代分瓶，一瓶使用50%原来推荐的培养基，50%新的培养基，另一瓶使用25%原来推荐的培养基，75%新的培养基，继续观察，如果细胞状态好，可以全部换成新鲜的培养基。
 
PS:
培养悬浮细胞，如何更换培养基？
如果空间足够，只需添加适量的新鲜培养基，这是培养悬浮细胞时更换培养基的方法（少数细胞除外）；也可以通过离心（1000g / 5min）去除旧的培养基后，用新鲜的培养基轻轻地重悬细胞，移入培养瓶。