原代细胞鉴定技术

一、形态学鉴定
1. 在倒置显微镜中直接观察活细胞的形态学特征
2. 细胞染色检查 ：
a) 将无菌玻片置于细胞培养皿中，加细胞悬液后培养；
b) 待细胞长满玻片后取出，用PBS清洗，之后放于载玻片上，待其自然干燥；
c) 用PBS/甲醇（1:1）固定15分钟；
d) 弃固定液，加合适的染色液染色；
e) 染色完毕后用清水洗净，置于空气中干燥，
f) 干燥后，用二甲苯透明，光学树脂封片后观察。

二、免疫组织细胞化学鉴定
1. 将无菌的盖玻片置于细胞培养皿中，将细胞悬液接种于培养皿中进行细胞爬片；
2. PBS清洗标本3次，各1 分钟；
3. 4%多聚甲醛固定15分钟；
4. 置于空气中干燥；
5. PBS清洗标本3次，各2 分钟；
6. 0.5%Triton X-100孵育 1次20分钟；
7. PBS清洗标本 3次 各2分钟；
8. 3%H₂O₂孵育 15分钟；
9. DPBS清洗标本 3次 各2 分钟；
10. 封闭血清孵育（5%正常二抗血清DPBS液20分钟）
11. 一抗孵育，4℃ 过夜或37℃ 60 分钟；
12. PBS清洗标本3次 各5 分钟；
13. 二抗工作液孵育（湿盒）37℃ 30 分钟；
14. PBS清洗标本3次 各5 分钟；
15. C液（湿盒） 37℃ 30 分钟；
16. PBS清洗标本3次，各5 分钟；
17. 用显色液进行显色；
18. 蒸馏水洗涤2次1 分钟；
19. 苏木素复染1分钟；
20. 清水洗涤30分钟；
21. 光学树脂封片后观察。