细胞计数与存活测试实验介绍

实验材料

    0.4 % w/v trypan blue (GibcoBRL 15250-061) 

    Erythosin bluish stain 
     
    取0.1 gram Erythrosin bluish (Sigma E-9259) 及0.05 gram preservative methyl paraben (Sigma H-3647) 溶于100 ml Ca /Mg free saline 

    血球计数盘及盖玻片(Hemocytometer and coverslip)

    计数器(counter)

    低倍倒立显微镜

     粒子计数器(Coulter counter, Coulter Electronics)

实验步骤

1 取50ml 细胞悬浮液与50ml trypan blue (or Erythrosin bluish) 等体积混合均匀于1.5ml 小离心管中。

2 取少许混合液(约15ml) 自血球计数盘chamber 上方凹槽加入，盖上盖玻片，于100 倍倒立显微镜下观察，活细胞不染色，死细胞则为蓝色(或红色- Erythrosin bluish)。

3 计数四个大方格之细胞总数，再除4，乘以稀释倍数(至少乘以2，因与trypan blue等体积混合)，后乘104 ，即为每ml 中细胞悬浮液之细胞数。若细胞位于线上，只计上线与右线之细胞(或计下线与左线之细胞)。
              
4 大格*细胞总数x 2 x 104 / 4= 细胞数/ml*每一大格的体积= 0.1cm x 0.1cm x 0.01cm = 10-4 ml

4 若不用血球计数盘，可用Coulter counter 作自动计数，惟无法辨别死细胞或活细胞。

5 范例：T75 monolayer culture 制成10ml 细胞悬浮液，取0.1 ml 溶液与0.1ml trypan blue 混合均匀于试管中，取少许混合液加入血球计数盘，计数四大方格内之细胞数目。

    活细胞数/方格：55 ,62, 49, 59
    死细胞数/方格：5, 3, 4, 6
    细胞总数= 243
    平均细胞数/方格= 60.75
    稀释倍数= 2
    细胞数/ml：60.75 x 104 x 2 = 1.22 x 106
    细胞数/flask： 1.22 x 106 x 10ml = 12.2 x 106
    存活率：225/243﹦92.6 %