贴壁/悬浮细胞瞬时转染-RFect质粒DNA转染操作步骤和注意事项

本文以RFect Plasmid DNA Transfection Reagent（RFect质粒DNA转染试剂盒），作为携带质粒穿膜的载体物质，具体介绍DNA转染方法。

图. 用本产品4ul转染1ug pEGFP-C2质粒到293T细胞后，绿色荧光蛋白的表达情况。

贴壁/悬浮细胞瞬时转染-RFect质粒DNA转染方法步骤:  

一、贴壁/悬浮细胞瞬时转染操作流程（以24孔板转染为例）

A. 细胞接种:
1. 转染前24小时左右对细胞进行转接，接种密度约为每孔0.3~1×10⁵个细胞； 
2. 过夜培养。

B. RFect /DNA复合物包装（该步完成后应立即转染）：
1. 在1.5 ml无菌离心管中加入50 μl无血清培养基，并添加适量的转染试剂（2~5 μl/μg DNA，参见下表）。用移液器轻轻混匀后在室温静置5~10分钟。 
2. 在1.5 ml无菌离心管中加入50 μl无血清培养基，并添加适量的DNA（0.8~1μgDNA/孔， 参见附表）。用移液器轻轻混匀后在室温静置5~10分钟。
3. 将RFect-培养基混合物滴加至DNA-培养基混合物中，用移液器轻轻混匀后在室温静置15~20分钟后，立即转染。注意： RFect-培养基混合物和DNA-培养基混合物的混合次序非常重要，切勿颠倒。

C.贴壁/悬浮细胞瞬时转染-RFect质粒DNA转染:
注意：RFect在*培养基中（基础培养基中添加血清）具有很高的转染效率，因此转染前后不需要换成无血清培养基。
1. 如特殊情况，可在转染开始之前更换新鲜的含血清培养基，以防转染后孵育阶段细胞密度太大、营养不足导致的细胞死亡。
2. 将步骤B制备的复合物滴加至培养基中。轻轻晃动培养皿以使复合物均匀分布。 
3. 过夜培养24~48小时。 
4. 注意:如果转染后需要更换新鲜培养基，请于加入RFect/DNA复合物12~24小时后进行。培养基更换后，孵育24~48小时后再进行后续实验。
5. 收获细胞，进行后续实验。

二、实验准备及注意事项：

1. 细胞接种：一般做转染前一天接种/铺板（细胞计数参见说明书,细胞计数大约5*10^4cell/ml），使做转染前细胞密度在30-50%；如果细胞是原代细胞，接种密度可以密一些，细胞计数在2*10^6cell/ml；悬浮细胞可以在转染当天接种/铺板（细胞计数大约5*10^4cell/ml），待细胞状态稳定后做转染前细胞密度30-40%。

2. 为了能在使用时有较好的转染效果，第1次使用建议您用24孔板做，每孔1ug质粒，设置质粒转染试剂2ul,3ul,4ul三个梯度，每个梯度做2-3个复孔（至少2个复孔，避免实验误差）。DNA 和转染试剂的比例，通常推荐是1:2-1:3。转染条件（质粒DNA与转染试剂的用量、比例）放大到对应的孔板即可。

3. 用来稀释siRNA和稀释转染试剂的培养基必须是无血清培养基，因为血清的存在会干扰DNA与转染试剂的混合，并且影响转染效率；

4. 检测方法：转染后48h收细胞做qPCR基因水平检测或者转染后72h收细胞提蛋白做western Blotting蛋白水平检测。

三、质粒DNA转染一般疑难问题及解决方法

1、低转染效率：  
1）转染试剂与质粒DNA的比例不合
根据建议选用配比浓度，详见下表。

 
2）细胞状态不佳，过密或过稀疏
细胞状态不佳，细胞营养不良，细胞伸展不好，细胞密度稀疏，细胞过密都影响转染效率。转染前24小时左右对细胞进行转接，接种密度约为每孔0.3~1×105个细胞即可。

3）抗生素损伤细胞
转染培养基中含有抗生素会影响细胞转染效率。因为转染试剂相当于细胞打孔，这时培养基中存在抗生素则会进一步损伤细胞。

2．高细胞毒性： 
1）质粒DNA受内毒素污染，或其他化学物质的污染
未使用去内毒素的质粒试剂盒提取质粒，对细胞损伤很大。转染过程中会造成细胞死亡。 

2）转染后换液
使用传统的转染试剂，转染后4-6小时必须进行换液，否则会由于转染试剂毒性而引细胞死亡。本实验所采用的RFect试剂盒在*培养基中具有很高的转染效率，操作简便，可用于含血清培养基培养细胞的转染，转染前后不需要更换培养液。