采用试剂盒因子法体外培养NK细胞的方法

Nk细胞又称自然杀伤细胞，是人体内抗癌活性免疫细胞之一，它在骨髓中发育成熟后，主要存在于外周血、肝脏、腹膜腔和胎盘中，在遇到肿瘤病变细胞时就会把它们杀死，同时也会刺激身体产生抗肿瘤的免疫反应，所以被医学界称为“抗癌的第1道防线”。

NK细胞主要分布于外周血，占外周血淋巴细胞总数的5-10％，无需抗原提呈细胞作为中介提呈抗原，也无需抗体帮助，可直接清除衰老细胞、变性细胞、癌细胞及病毒感染细胞等。

NK细胞属于白细胞的一种，它是人体忠诚的卫士，主要任务就是消灭那些已经被病毒感染的细胞，从而把病毒消灭在“摇篮”中。另外，身体里面的肿瘤细胞也是它们追杀的对象。

NK细胞在机体免疫监视和早期抗感染免疫过程中起到非常重要的作用，是一种有效、安全的肿瘤生物免疫治疗方法，具有广阔的应用前景。

分离培养NK细胞有多种方法，以下是采用某种试剂盒的因子法体外培养方法来培养NK细胞：

这种方法采用自体外周血细胞中分离得到的单个核细胞，经体外操作使NK细胞扩增活化，通过激活体 内特异性免疫反应达到杀火肿瘤细胞目的的一种体细胞治疗方法。

1.NK细胞培养试剂盒包含：
①无血清培养基2瓶（l000mL/瓶）：
②NK试剂A, 1支：
③NK试剂B, 1支：
④NK试剂C, 1支:
⑤NK试剂D, 1支：
⑥NK试剂E, 1支：
培养体系中需用到2支（100万IU/支）rH IL-2
2.原材料
1.采取外周血（可从脐血、骨髓等组织）
2.需的试剂耗材包括：
0.4%苔盼蓝溶液、生理盐水、人淋巴细胞分离液（建议选用GE）、175cm²培养瓶、GT-T610 （A）培养袋、15ral/50ml/250ml离心管、移液管、1毫升无菌注射器
3.NK细胞培养时间过程:
前一天：要提前处理好细胞活化瓶（NK试剂A）
第1天：进行外周血单个核细胞分离与诱导(NK试剂B）
第3天：NK细胞第1次补液，补液50ml（NK试剂C）
第5天:NK细胞第二次补液，补液175ml (NK试剂D）
第7天：NK细胞第三次补液，装袋并补液500ml (NK试剂E)
第9-10天：NK细胞第四次补液，分袋并补液750ml
第12天：NK细胞第五次补液.补液500ml
第13天：检菌
第14、15天：培养成功
（细胞培养成功时间视具体细胞生长情况而定，在保持培培养基ph和细胞活力正常的情况下也可以多培养一天）
4.具体操作步骤如下：
1.头一天一定要先处理细胞活化瓶。
2.将NK试剂A （4度保存）加入到含有12.5ml生理盐水的175cm²底面积细胞培养瓶中，充分的混匀 30秒-1分钟,使液体充分在瓶底分散，4度冰箱平放过夜
(NK试剂A需要和生理盐水充分混匀平铺在瓶底；次日取出后直接吸弃液体即可，无需清洗）
3.外周血单个核细胞分离与诱导（第1天）
4.以100ml外周血为例，如血量不同，也可按操作规程做相应调整。
5.将患者外周血，用移液讶吸取少许原血（约300 ul）划线或滴入平皿过行检菌。然后，正常室温下,进行离心。
6.将上层血浆转入离心，灭活，离心，取上清液备用。
7.使用等体积的生理盐水与血细胞沉淀混匀后，小心加到Ficoll层上，使分层保持清晰。室温内进行离心。
8.吸取外周血单个核细胞(PBMC）层，尽量吸尽两液面交接处的细胞层.加生理盐水吹打混匀，离 心。相同方法冉次洗涤细胞。
9.弃去上清后，用无血清培养基重悬细胞,吸取少量细胞计数。
10.按照细胞密度为1-2*10^6个/ml(5 *10^6个/ml）,用培养基清洗离心管，并入培养瓶内，并加入1支NK试剂B，患者灭活血浆1.25ml (5%）确保培养基终体积为25ml左右。剩余血浆4°C 密封保存备用。
    注：包被瓶取出时间为细胞加入前5分钟,其他时间需在4度放置备用。
    试剂A、B、C、D、E的取用.違议第1次吸取原液后.以适貴培养基冲洗西林瓶后再吸出，以大程度减少损耗
11.活化培养基的配置：其中1瓶无血清培养基中，加入100万IU的IL-2，终浓度为1000IU/mL。
      注：活化培养基每次使用前恢复至室温。
12.NK细胞的第1补液（第3天），补加含有5%的患者灭活血浆和NK试剂C，确保培养的终体积为 75mL。
13.NK细胞的第二次补液（第5天），补加含有5%的患者灭活血浆和NK试剂D,确保培养的终体积为 250ml.
14.NK细胞的第三次补液及其装袋（第7天），细胞转袋前将培养瓶底部的细胞进行轻微吹散细胞，随后将培养瓶的中的细胞悬液及其500mL活化培养基，装入到细胞培养袋中，同时加入1支NK试剂E，及其剩余的全部血浆，确保终体积为750ml。
15.NK细胞的第四次补液（第9天），主要为分袋操作，将培养体系由750ml扩增至1500ml。
16.NK细胞的第五次补液（第!2天）.主要为补液操作，将剩余的500mL扩增液均分到2个培养袋中，确保每袋体积为1000ml。
17.检菌，细胞培养第13天，对细胞悬液进行检菌、内毒素检测。用5ml注射器分别从培养瓶和袋内抽取少细胞悬液，加入正置的平皿中，放入35℃恒温生化培养箱， 记录放入日期及培养物品。隔夜后倒置，保留48小时。
18.收获，正常情况下，第13, 14天各收获1000ml细胞悬液。若因临床需要进行提前或延迟回输，也可相应提前或延迟。（NK细胞建议2-4h之内使用，以保证其活性）