蛋白酶K，是一种切割活性较广的丝氨酸蛋白酶。它切割脂族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽键。此酶经纯化去除了RNA酶和DNA酶活性。由于蛋白酶K在尿素和SDS中稳定，还具有降解天然蛋白质的能力，因而它应用很广泛，包括制备脉冲电泳的染色体 DNA，蛋白质印迹以及去除DNA和RNA制备中的核酸酶。蛋白酶K的一般工作浓度是50—100μg/ml。在较广的pH范围内(pH 4-12.5)均有活性。推荐反应缓冲液：50mM Tris-HCl (pH7.5),10mM CaCl2 。
蛋白酶K配制标准：20mg/ml蛋白酶K配制标准(proteinase K)：将200mg的蛋白酶K加入到9.5ml水中，轻轻摇动，直至蛋白酶K*溶解。不要涡旋混合。加水定容到10ml，然后分装成小份贮存于-20℃。
蛋白酶K的保存：保存在-20℃冰箱里，避免反复冻融，有效保证12月。
孵育温度为55至65℃，理想孵育温度为58℃，孵育时间为15分钟至48小时;理想孵育时间为2小时。
作用：蛋白酶K在原位杂交技术中通常用于杂交前的处理，它具有消化包围靶DNA蛋白质的作用，以增加探针与靶核酸结合的机会，提高杂交信号.但蛋白酶K的浓度过高、消化时间过长或孵育温度过高时，都会对细胞的结构有一定的破坏，导致组织切片的脱落，细胞核 的消失，从而影响杂交结果。EDTA缓冲液可以替代蛋白酶K的作用，解决上述出现的问题，并能达到理想的染色效果。
蛋白酶K的应用比较广泛，它可以消化包围靶DNA蛋白，因此使用蛋白酶K能够增加探针 与靶核酸结合的机会增强杂交信号，但在使用蛋白酶K时要主要使用的浓度，过高或者过低都会破坏细胞的结构、核消失等影响试验结果。
