对细胞培养中一种黑色运动颗粒物的说明

在细胞培养中常可见到细胞及培养液中有一些大小不等、形态不同的黑色颗粒在运动。如果镜下检查(100x)每视野计数在 10 个以上者就可能使细胞生长受到影响，如果其数量再增多细胞可停止增殖继而死亡。人们常称这种颗粒为黑胶虫或中毒颗粒。

Ø 关于黑胶虫的描述

ü 分类上的描述

对于黑胶虫的分类，学术界没有明确给予说法。关于黑胶虫的分类，目前大部分人认为黑胶虫污染是微生物感染。在一些文章论述上把黑胶虫归为生物污染类型，但是没把它归为确定的生物分类类型，只是把黑胶虫独立为一种未知生物。而根据中国病毒所和军科院鉴定是一种寄生于牛血清内的一种原虫，似乎和草履虫和变形虫有类似之处，但是由于课题经费不够而不能继续下去，终也没有有力证明黑胶虫是属于原虫。也有一些学者不认为所谓的黑胶虫污染是一种生物污染，而认为是细胞碎片类物质，是在细胞培养时，细胞衰亡破裂产生的；也有在文献中报道说是玻璃瓶中类似氧化硅的物质，那个文献很少人找得到；还有报道黒胶虫是一种纳米级的细菌。

ü 形态上的描述

形态上类似与杆状细菌，但长度比细菌长，直径约在 0.5~1 微米，不染色观察为黑色；胶虫成熟后呈线状，而且形态是椭圆形。

ü运动形式

在400x 倒置显微镜小，有典型的布朗运动（不规则的原地小距离抖动），即很多细胞培养者看到的，像黑色的小虫游来游去。可以穿透滤膜，也可以通过 空气传播，低倍下为黑色点状，高倍下可看见黑色的小虫游来游去。但是在物理学上来说，颗粒足够小，在液体中也是做布朗运动的，这不足以说明黑胶虫的布朗运动就证明它是生物。

ü 生理上的描述

抗性

抗细菌和抗霉菌的药物对黑胶虫均无效，可以保守的判定黑胶虫不属于细菌。

环境抗逆性

将培养器材 150 度烘烤 8 小时，可以消除，这个黑胶虫高压灭菌泡酸都不死。可见黑胶虫可以耐高温高压，而且还有点嗜酸，如果证实它是生物的话，那它很有可能是微生物，一种古菌。

营养条件

“黑胶虫”可寄生于动物细胞，也可以生存于培养基中，依靠细胞和培养基中的营养为生，并随细胞传代而传代。可见“黑胶虫”可能是一种异养生物。

Ø 对黑胶虫的各种猜测及相应的处理

ü 非生物类

细胞碎片类

在细胞培养的时候，由于细胞代谢、物质交换、周边环境变化，尤其是在从 37 度培养箱中拿出来观察的过程中，由于液体培养基的比热较大，液内温度高于外界温度，造成冷热交换、小范围内形成液体流动加剧，当然这些小岁末就会被搅动起来形成似乎“游动”的感觉；随着细胞培养的继续，部分细胞开始衰亡，细胞膜结构破裂，破裂之后的细胞内容物泄露到培养液中。尤其是溶酶体的破坏，连续性地造成其他细胞和细胞器的损伤，如果换液不很勤，又会出现进一步破坏和残渣的出现；再者，“黑胶虫”问题是很多细胞培养者已经发现的问题，但到目前为止尚未找到其监测和排除的试剂和手段，这首先是由于所谓“黑胶虫”病原体根本难以收集和捕捉，这也从另一个侧面证明了“黑胶虫”问题的难以确定性；再说任何一种外来的微生物在培养基中都会有生命活动的反应和表现，而不是简单地运动那样的外观性表现。举一个例子：如果“黑胶虫”的运动状况已经到了用显微镜已经可以观察出的程度，其营养代谢和能量需求也就可想而知。这样，培养液中的影响消耗、酸碱含量程度等都要发生明显变化。比如说：迅速的、大含量的沉淀，pH 值的迅速下降，细胞大量破碎死亡、引发其它类型微生物侵染等等。而这些状况，在所谓的“黑胶虫”感染中，是很难观察到的。同时“黑胶虫”的出现而影响细胞状态似乎得不到有力的证据。倒是细胞状态下降的时候，“黑胶虫”明显增多了。很有可能是细胞状态下降时，细胞衰亡产生的细胞碎片。所以黑胶虫属于细胞碎片是比较可能和合理的。

玻璃培养瓶中的类似氧化硅的东西

网上有一篇文章说，黑胶虫其实不是一种生物，是无机物，其本质是玻璃培养瓶里的硅颗粒。可影响细胞生长，细胞状态好时，不明显。细胞状态较差，数量少时才容易看到，可用一次性培养瓶，可消除黑胶虫影响。

血清聚合物产物

Gibco 公司的血清说明，此物为血清聚合产物，而不是微生物。

ü 生物类

支原体

有人曾认为黑胶虫可能是支原体污染，因为相对比较的网站文章指出，黑胶虫可以通过滤膜，可以在空气中传播。而恰巧口腔支原体为人体口腔中之正常菌丛，所以实验室之操作人员的污染亦可能为支原体的污染源。但有人为此做了实验证明黑胶虫不会是支原体，原因如下：

1、光镜下可见,因为体积不对，支原体在普通显微镜下不能看到。 

2、多种染色后可见，甚至 hoechst 即能将它染色,一般来说支原体用普通染色法不易着色，用姬姆萨染色很浅，革兰染色为阴性。所以，黑胶虫是一种支原体的可能性比较小。

真菌

有很多人发现类似黑胶虫的，但后确定是真菌，二性霉素 B 对其有效。那说明黑胶虫不存在只是细胞培养中的真菌感染，还是说明黑胶虫污染属于真菌类污染物。如果黑胶虫是一种真菌，那么由此引起的污染是不会引起那么多人的关注，即使它很特殊。但是这不能排除那些认为“黑胶虫”是真菌的细胞者，看到的只是一般真菌感染。由于细胞被感染了，要进行拯救处理，不像理论上那么简单，稍有不注意都是很容易导致培养失败，所以黑胶虫是一种真菌也是不太可能。

寄生类原虫

黑胶虫属于寄生类的原虫，而不是细菌、支原体，也不是什么补体、细胞碎片或蛋白沉淀。有人在 400 倍以上的高倍镜下可以清楚的看到胶虫有两种不同形态，一种较大，运动较慢，泛红光；另一种较小，运动较快，红中带绿，个小的围着个大的分布，很可能是公的围着雌的。这种生物也并非离开细胞就不能存活，也有人做过这样的试验，单纯培养过污染胶虫的血清 4 周，直到满视野都是黑煤渣般的胶虫。给人的感觉是胶虫和细胞一样有丛集性，如果胶虫密度低则生长缓慢，如果手懒，拖了几天没换液，待胶虫生长到一定浓度后便会飞速分生，细胞受感染的程度也大，这时除了培养基中可见外，细胞表面通常也象长满了粉刺，所以有人认为细胞旁分泌的某些因子可以抑制胶虫的生长。据说，中国病毒所和军科院鉴定是一种寄生于牛血清内的一种原虫，似乎和草履虫和变形虫有类似之处，然而由于课题经费不够而不能继续进行下去，所以并没有明确的证据证明此项猜测的正确性。

Ø解析

从前面关于黒胶虫的描述可以看出，人们遇到的黒胶虫并不都是一样的，有像细菌的、有像支原体的、有像原虫的、有像真菌的，还有像细胞碎片的。在国内各实验室的器材条件参差不齐，而且实验人员的操作质量也不尽相同，同一种现象也可能有些许差异，当用描述出来的现象的差异可能变大也可能变小。所以很多人看到细胞被细菌污染了，不好处理，而却描述出来的现象和流传的黑胶虫类似，就会把培养失败的原因归结到的黒胶虫污染，甚至可能说它发现的是真正的黑胶虫。这样的事情多了，黑胶虫就会人为的变种，像什么的都有。黑胶虫是否存在，还有待于科学的发展。但有一点可以肯定的，大部分人发现的“黒胶虫”并不是真正那个未知的黒胶虫，而是常见的细菌、真菌、原虫等微生物污染。

Ø关于黑胶虫的报道

在《细胞生物学杂志》有一篇关于《对细胞培养中一种黑色运动颗粒性质的研究》论文，文中经过多种实验验证后指出：“在组织培养中常观察到一种大小不等、形态不同的黑色运动颗粒,它对培养细胞的生长有不良影响,有时甚至导致细胞死亡，并能在一定条件下随着时间的增长而增加其数量。人们称这种颗粒为黑胶虫或中性颗粒。我们取细胞培养中的血清，培养基和其他材料中的黑色运动颗粒，用光学显微镜，透射电镜和扫描电镜对其形态学进行系统观察，并用显微镜摄影观察期活动情况，用紫外分光及电泳透析进行圣生化分析。结果均证明该颗粒为无膜式结构，无蛋白质成分，中性环境下带正电荷，能谱扫描电镜分析为硅复合物，我们称之为硅小体。郑证明其活动为布朗运动。