细胞不贴壁的原因及解决

我们可能都有过这样的经历：

辛苦呵护的细胞，怎么也不愿意贴壁；

贴壁了又很容易成块或者成团掉下来；

原本贴壁的细胞，复苏后细胞不贴壁了；

........

遇到这样的问题你都如何解决？

这次我们就来聊聊

什么是贴壁细胞？

贴壁细胞原理？

细胞贴壁和什么有关？

为啥你的细胞不愿贴壁呢？

如何促进细胞贴壁？
 

根据细胞特性分类

1、 悬浮细胞（Suspension Cell）

细胞生长不依赖支持物表面，在培养液中呈悬浮状态生长，如淋巴细胞。

2、 贴壁细胞（Adherent Cell）

在动物细胞培养过程中，必须有可以贴附的支持物表面，依靠自身分泌或培养基中的粘附因子才能在该表面生长增殖的细胞。当细胞在该表面生长后，一般形成两种形态，即成纤维样细胞或上皮样细胞。

▲ 细胞形态

3、 兼性贴壁细胞

有些细胞并不严格地依赖支持物，它们既可以贴附于支持物表面生长，但在一定条件下，也可在培养基中呈悬浮状态生长。

贴壁细胞分为：上皮细胞型，成纤维细胞型，游走细胞型和多型细胞型，在显微镜下观察时，贴壁细胞在瓶底伸展并延伸成梭型或不规则的三角形或扇形或其他形态，而且晃动培养液时，细胞不动。常见的贴壁细胞有成纤维细胞、骨骼组织（骨及软骨）、心肌与平滑肌、肝、肺、肾、乳腺皮肤、神经胶质细胞、内分泌细胞、黑色素细胞以及各种肿瘤细胞等。

体外培养贴壁细胞特点

贴附并伸展，是多数体外培养细胞的基本生长特点。细胞贴壁的过程使形态发生很大变化，细胞形态改变是细胞内骨架（真核细胞中的蛋白纤维网架体系，由微管、微丝及中间纤维组成的体系）本身和细胞外基质共同作用的结果。培养细胞在未贴附于底物之前一般均似球体样，当与底物贴附后，细胞将逐渐伸展而形成一定的形态，呈成纤维细胞样或上皮细胞样等。细胞附着于底物时并非一种需要能量的过程，一般认为与电荷有关。据资料记载，37℃时在2min内细胞之间即可形成键，该键可对0.01%胰蛋白酶起作用且仅发生于细胞间，细胞与底物之间则无；8min后才有稳定的键形成。

贴壁细胞（除肿瘤细胞外）在体外培养条件下，完成贴壁后均为单层生长，原因是贴壁细胞有接触性抑制的特点。一般认为接触抑制是细胞间的一种识别作用，对于动物细胞的形态形成与稳定具有重要性的作用。由于贴壁细胞的一面是紧贴在培养瓶上的，如果其上方存在细胞与其相粘附，那么下方的细胞很快就会缺乏营养---饿死。

接触抑制：

1954年，由艾伯克龙比发现，一些细胞在生长过程中达到相互接触时停止分裂现象，将其命名为接触性抑制（Contact Inhibition），后来证实接触性抑制普遍存在于贴壁细胞之间。

接触抑制的原理：细胞膜上有糖类和蛋白质共同构成的糖蛋白，也叫做糖被，它在细胞上起识别作用，当细胞增殖到一定程度，挨在一起时，糖蛋白就会识别这种信号，并且使细胞停止繁殖。

▲ 单层生长

细胞为什么要贴壁

首先并不是所有的细胞在体外培养的情况下都会贴壁，但大部分来自实体组织器官的细胞都会贴壁。

密度大于培养基的细胞（绝大部分细胞）通过重力作用会沉降在底面上，这是种自然属性，那么细胞要生存必定得改善这个环境，也是贴壁的主要原因-分泌细胞外基质和粘附因子（Extracellular matrix& Cell Adhesion Molecules，ECM&CAM），改善底面的结构，然后很自然就贴附在底面上了。

细胞粘附分子：

是众多介导细胞间或细胞与细胞外间相互接触和结合分子的统称。

细胞外基质：

是由动物细胞合并分泌到胞外、分布在细胞表面或细胞之间的大分子。

二者大多数均为糖蛋白，因此具有较强的亲水性——因此能不能贴壁不仅仅关乎细胞是否有这种能力，也与有无合适的底物（培养瓶）有关。

▲ 原理图（图源网络）

密度小于水的细胞，如脂肪细胞，漂浮在液面上，所以不可能贴在底面上，但是如果将培养液加满，那么细胞能够与培养瓶上面的壁接触同样可以贴壁。因此可以说，细胞贴壁是适应环境的一种反应。

细胞贴壁原理及相关因素

大多数的哺乳动物细胞在体内和体外均附着于一定的底物而生长，在体外时这些底物可以是其他细胞、胶原、玻璃或塑料等。

贴壁的过程：细胞首先分泌细胞外基质，这种细胞外基质黏附在支持物的表面（培养瓶，培养皿的底面）。然后，细胞通过其表面表达的黏附因子与这些细胞外基质结合。

▲ 贴壁过程

一些特殊的促细胞附着物质（如层粘连蛋白、纤维连接蛋白、Ⅲ型胶原、血清扩展因子等）可能参加细胞的贴附过程。这些促细胞附着因子均为蛋白质，存在于培养液尤其是血清中。在培养过程中，这些带阳电荷的促贴附因子先吸附于底物上，悬浮的圆形细胞再与已吸附的有促贴附物质的底物附着，以后细胞将伸展成其原来的形态。所以细胞贴壁与否和细胞本身分泌细胞外基质的能力以及细胞本身表达的黏附分子的数量有关，也与培养皿壁的表面结构有关。

细胞不贴壁的一些原因

• 1. 胰酶消化时间把控不当：消化不够细胞本身就是成团的；若胰酶处理太久，容易造成细胞膜蛋白损伤，使细胞贴壁不紧，显微镜下观察立体感不强，严重的时候甚至会造成细胞死亡。

• 2. 缺少贴壁因子：血清中含有促贴壁因子，而无血清培养基工艺中由于缺少这种促贴壁因子，细胞的贴壁效果会下降很多。

• 3. 支原体或细菌的污染。

• 4. 培养液配制、储存不当，如pH值过碱，Gln量太少等原因。

• 5. 复苏的细胞本身状态不好，已经老化，失去贴附性。

• 6. 接种细胞数目太少，无法分泌足够的细胞外基质。

• 7. 复苏时处理速度太慢，复苏过程不当。
   

如何促进细胞贴壁

• 1. 适度消化细胞：HepG-2、A549、Hela、SGC-7901几种癌细胞处理时间可适当放长，一般处理5-6min，C2C12、COS-7、NIH-3T3比较容易脱落，2min足矣，P19Cl6和293细胞贴壁不紧，可在PBS漂洗后，直接换新鲜培养基打散。

• 2. 用塑料瓶培养，如果是玻璃瓶,那么可以用鼠尾胶原包被一下培养瓶，或者用盐酸对培养瓶进行蚀刻，或者涂Laminin/fibronectin/collagen/BSA，也可以帮助细胞贴附新的培养瓶，细胞不易贴壁，建议加多聚赖氨酸处理。

• 3. 正确配制消化液或培养液。

• 4. 使用合适的细胞外基质或贴壁试剂。

• 5. 复苏新的细胞，第1周用20%血清帮助细胞复原。

• 6. 传代接种一定要铺的均匀，避免细胞抱团生长。

• 7. 细胞传代24小时之内，不要晃动，以免影响贴壁。

• 8. 体内上皮细胞生长在胶原构成的基膜上，因此培养在有胶原的底物上有利于生长。人或小鼠表皮细胞培养，可以用γ射线照射后的3T3细胞为饲养层，另外降低pH、Ca²⁺含量和温度，均有利于上皮细胞生长。

  　　Countess3细胞计数仪虽然是一款高效的细胞计数工具，但它本身并不直接涉及细胞贴壁的问题。

  　　细胞不贴壁是在细胞培养过程中常见的问题，可能会影响到实验结果的准确性和细胞的正常生长。

  　　以下是关于细胞不贴壁的一些原因及可能的解决方案：

  　　细胞不贴壁的原因：

  　　培养基条件不适：

  　　pH值不适当：理想的细胞生长pH范围通常在7.2到7.4之间。过高或过低的pH值都可能影响细胞贴壁。

  　　营养不足：培养基中的营养成分不足或比例不适当，可能导致细胞无法正常贴壁生长。

  　　氧气或二氧化碳浓度不适：特别是在CO2孵化器中，不恰当的CO2浓度会影响培养基的pH值，从而影响细胞贴壁。

  　　细胞本身的问题：

  　　细胞状态不佳：如在传代过程中受损或冻存复苏过程中受到影响的细胞，可能活力下降，导致无法正常贴壁。

  　　细胞类型特性：有些细胞类型(如悬浮细胞系)自然不易贴壁，需要特殊的培养条件或添加特定的附着因子。

  　　培养容器问题：

  　　容器表面处理不当：细胞可能需要经过特殊处理的表面才能有效贴壁，如胶原蛋白或纤维连接蛋白涂层。

  　　容器污染：微生物污染或化学污染也可能影响细胞的贴壁。

  　　操作技术：

  　　播种密度不当：播种密度太低或太高都可能影响细胞的贴壁和生长。

  　　操作过程中的机械损伤：过度的吸吐或剧烈的震荡可能会损伤细胞，导致其无法贴壁。

  　　解决方案：

  　　调整培养基条件：确保pH值、营养成分和气体浓度处于适宜范围。

  　　优化细胞状态：选择健康、活力好的细胞进行培养，避免使用受损或状态不佳的细胞。

  　　选择合适的培养容器：根据细胞类型选择合适的培养容器，并确保其表面处理适合细胞贴壁。

  　　提高操作技术水平：避免在细胞操作过程中造成不必要的机械损伤，合理控制播种密度。

  　　引入附着因子：对于不易贴壁的细胞类型，可以尝试添加特定的附着因子来促进细胞贴壁。

  　　使用悬浮培养方法：对于某些自然不易贴壁的细胞类型，可以考虑使用悬浮培养的方法进行培养。

  　　解决细胞不贴壁的问题需要从多个方面综合考虑，包括培养基条件、细胞状态、培养容器和操作技术等。通过优化这些条件和技术，可以有效地促进细胞的贴壁和生长。